Hoje, a Yaohai está muito empolgada para compartilhar seu protocolo de transcrição in vitro para RNA longo. É uma estratégia eficaz que os cientistas frequentemente utilizam para produzir RNA no laboratório. Dessa forma, os pesquisadores podem produzir uma quantidade significativamente grande de RNA longo — algo essencial para o estudo em diferentes campos biológicos. Aqui, fornecemos um guia passo a passo para a preparação de RNAs longos por meio de transcrição in vitro. Também discutiremos como podemos melhorar o processo e tentaremos abordar alguns dos problemas que você enfrenta na síntese de RNA longo.
Vários componentes essenciais são necessários para a transcrição in vitro, especialmente para RNA longo. Você precisará fornecer uma enzima chamada polimerase de RNA, material de escrita na forma de trifosfatos de nucleotídeos (NTPs), um tampão para auxiliar na reação e algum DNA template. Como fazer isso passo a passo, você pode encontrar um guia detalhado aqui:
Vários fatores são muito importantes para o bom funcionamento da síntese de RNA. Notavelmente, a quantidade de íons de magnésio no próprio tampão é importante. A RNA polimerase requer uma quantidade considerável de Magnésio para apoiar a interação adequada com o DNA template e a subsequente dobra do RNA. Um segundo aspecto importante a considerar é a concentração de DNA template. Especificamente, você deve ter template DNA suficiente na reação para obter bons rendimentos de RNA.
O RNA longo, é claro, virá com seu próprio conjunto de problemas. Esses problemas podem estar relacionados à degradação do RNA, afetar como o RNA se dobra e formar estruturas que potencialmente interferem na síntese do RNA. Uma maneira de enfrentar esses desafios é ajustando o tampão que você utiliza. Para uma estrutura mais abrangente do RNA, os pesquisadores podem adicionar diferentes produtos químicos especiais, como DTT e p-mercaptoetanol, para ajudar o RNA a se dobrar corretamente e evitar que ele grude ou forme agregados.
Além disso, nem todos os tipos de RNA longo são iguais e alguns podem exigir métodos alternativos de síntese. Existem características especiais que os pesquisadores podem precisar adicionar ao RNA, como a adição de um cap 5 ou cauda Poly-A. Se isso for necessário (como explicado posteriormente), então os pesquisadores devem incluir outras enzimas, como Guanylyltransferase e Poly(A) Polymerase. Também é necessário selecionar uma enzima polimerase de RNA apropriada, que naturalmente permite que eles produzam mais RNA. Assim que o RNA longo precisar ser sintetizado, será necessário identificar a melhor condição.
Transcrição in vitro de RNAs longos. Existem várias aplicações-chave para o protocolo de transcrição in vitro de RNAs longos em diversas áreas de pesquisa, ensaios e terapias. Ele ajuda os cientistas a entender a estrutura do RNA, como ele funciona e como podem modificar genes com tecnologias contemporâneas. A cada dia, novas descobertas sobre diversas doenças e suas terapias, como as atuais terapias de RNA, nos mostram o quão útil essa tecnologia pode ser para a medicina.
Há muitas vantagens em usar este protocolo. Um método baseado em eletroforese geralmente é a maneira mais eficiente e custo-benefício de produzir grandes quantidades de RNA longo. Além da qualidade do RNA, um bom rendimento também é um fator importante para os pesquisadores, auxiliando-os em suas pesquisas, especialmente se eles precisarem de grandes quantidades de RNA para experimentos devido à alta quantidade de material de entrada necessária. Além disso, a transcrição in vitro de RNA longo normalmente é mais precisa e reprodutível do que a síntese química ou a síntese celular de RNA.
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