Aujourd'hui, Yaohai est très excité de partager son protocole de transcription in vitro pour les ARN longs. C'est une stratégie efficace que les scientifiques utilisent souvent pour produire de l'ARN en laboratoire. De cette manière, les chercheurs peuvent produire un nombre significativement élevé d'ARN longs — quelque chose d'essentiel pour l'étude dans différents domaines biologiques. Ici, nous fournissons un guide étape par étape pour la préparation des ARN longs via la transcription in vitro. Nous parlerons également de la façon dont nous pourrions améliorer le processus et tenterons de résoudre certains des problèmes que vous rencontrez lors de la synthèse d'ARN long.
Plusieurs composants essentiels sont nécessaires pour la transcription in vitro, surtout pour les ARN longs. Vous devrez fournir une enzyme appelée polymérase ARN, des matériaux d'écriture sous forme de triphosphates de nucléotides (NTPs), un tampon pour aider à la réaction, et un certain modèle d'ADN. Pour savoir comment procéder étape par étape, vous pouvez trouver un guide détaillé ici :
Plusieurs facteurs sont très importants pour le bon fonctionnement de la synthèse de l'ARN. Notamment, la quantité d'ions magnésium dans le tampon lui-même est importante. La polymérase ARN a besoin d'une grande quantité de magnésium pour soutenir une interaction appropriée avec le modèle d'ADN et le pliage subséquent de l'ARN. Un deuxième aspect important à considérer est la concentration de modèle d'ADN. Plus spécifiquement, il faut avoir suffisamment de modèle d'ADN dans la réaction pour obtenir de bons rendements d'ARN.
L'ARN long, bien sûr, sera accompagné de son lot de problèmes. Ces problèmes peuvent être liés à la dégradation de l'ARN, affecter la manière dont l'ARN se plie, et former des structures qui pourraient interférer avec la synthèse de l'ARN. Une façon d'aborder ces défis consiste à ajuster le tampon que vous utilisez. Pour une structure d'ARN plus complète, les chercheurs peuvent ajouter différents produits chimiques spéciaux tels que le DTT et le p-mercaptopropanol afin d'aider l'ARN à se plier correctement et d'éviter qu'il ne s'agglutine ou ne forme des grumeaux.
De plus, tous les types d'ARN longs ne sont pas identiques et certains peuvent nécessiter des méthodes de synthèse alternatives. Il existe des caractéristiques spéciales que les chercheurs pourraient devoir ajouter à l'ARN, comme l'ajout d'un chapeau 5' ou d'une queue Poly-A. Si cela est nécessaire (comme expliqué plus loin), les chercheurs doivent inclure d'autres enzymes telles que la Guanylyltransférase et la Poly(A) polymérase. Il faut également choisir une enzyme polymérase appropriée qui permet naturellement de produire plus d'ARN. Dès que de l'ARN long doit être synthétisé, il sera nécessaire d'identifier les meilleures conditions.
Les ARN longs en transcript in vitro ont plusieurs utilisations clés dans divers domaines de recherche, d'analyse et de thérapie. Ils aident les scientifiques à comprendre la structure de l'ARN, son fonctionnement et la manière dont ils peuvent modifier les gènes avec des technologies contemporaines. Chaque jour, la découverte de nouvelles maladies et de leurs traitements, comme les très récentes thérapies à base d'ARN, nous montre à quel point cette technologie de lecture peut être utile en médecine.
Il y a de nombreux avantages à utiliser ce protocole. Une méthode basée sur l'électrophorèse est généralement la manière la plus efficace et coûteuse pour produire de grandes quantités d'ARN long. En plus de la qualité de l'ARN, un bon rendement est également un facteur important pour les chercheurs afin de les aider dans leurs recherches, surtout s'ils ont besoin de grandes quantités d'ARN pour les expériences en raison d'un matériau d'entrée important. De plus, la transcription in vitro pour l'ARN long est généralement plus précise et reproductible que la synthèse chimique ou la synthèse cellulaire d'ARN.
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