Iskorišćavanje snage strategije fermentacije u fed-batch režimu

Pichia pastoris se široko koristi u proizvodnji različitih heteroloških proteina. Tehnologija fermentacije visoke gustoće stanica (HCDF), implementirana kroz Fed-Batch dojenje, je uspešno postigla velomaskalnu proizvodnju biofarmaceutsaka i industrijskih enzima. U precizno kontrolisanim sredinama, upotreba HCDF tehnologije može da dokaže visoku dobijenu količinu, visoku aktivnost i ekonomične rekombinantne proteine.

Nedavna istraživanja ukazuju da se pomoću strategija HCDF radi na povećanju proizvodnje i aktivnosti heteroloških proteina u Pichia pastoris. HCDF tehnologija omogućava lako postizanje visokog nivoa klastera stanica u definisanim sredinama, čime omogućava dobijanje obilnih rekombinantnih proteina sa poboljšanom aktivnošću i smanjenim troškovima preko HCDF. Međutim, izbor odgovarajuće HCDF strategije za optimizaciju visokoniveleksprerija specifičnih proteina u Pichia pastoris ostaje izazov.

Fermentacija visoke gustoće stanica (HCDF)

Pichia pastoris iznosi se u proizvodnji heteroloških proteina, što je omiljeno za HCDF u automatizovanim bioreaktorima. HCDF ima 3 faze: serija na glicerolu, hrđanje i indukcija metanolom. Yaohai Bio-Pharma poseduje preko deset godina iskustva u mikrobijskoj fermentaciji i obavila je preko 400 projekata. Kompanija poseduje širok stručni znanje i dobro razvijenu tehnologiju, što joj omogućava da koristi različite strategije HCDF kako bi poboljšala efikasnost proizvodnje proteina.

Metanol služi kao induktor AOX1 i kao izvor ugljenika, ali njegova koncentracija mora biti kontrolisana kako bi se sprečila toksičnost. Procenjivanje različitih strategija hrđanja metanolom ključno je za optimizaciju rasta Pichia pastoris i ekspresije proteina.

Strategija indukcije metanolom

U strategiji indukcije metanolom u HCDF procesu s serijskim dodavanjem, stanje-izvestaj bazirane strategije obuhvata skup metoda upravljanja koje regulišu dodatak metanola kroz onlajn/offlajn ili unapred/nazad kontrolu. Među statističkim metodama indukcije, glavne uključuju μ-stat, Dissolved Oxygen (DO)-stat, metanol-stat i biomass-stat.

1.1 μ-stat

μ-stat strategija održava stalnu biomase kontrolisanjem μ, što pomaže u reprodukcionosti i proučavanju uticaja μ na izraz proteina. Međutim, nedostaje joj direktna kontrola metanola i DO-a, što nosi rizik akumulacije i generisanja ROS-a.

1.2 DO-stat

Dok DO-stat strategija neizumno reguliše davanje metanolа kontrolisanjem disolviranog kisika kako bi se održao oksigenacijom, ona ne fiksira koncentraciju metanolа i brzinu rasta, što može uticati na proučavanje izražavanja proteina. Oksigenacija predstavlja izazov u aerobnoj fermentaciji, dok je davanje čistog kisika moguće skupo i toksično, poboljšanje tlaka je ekonomičniji pristup koji takođe može poboljšati aktivnost proteina.

1.3 Metanol-stat

Nedovoljna kontrola koncentracije metanolа stavlja ograničenja i μ-stat i DO-stat strategijama. Metanol statističke strategije koje rade u režimu uključeno/isključeno su podložne fluktuacijama i nedostaju im preciznost. U protivnosti sa tim, PID kontroleri nude precizniju regulaciju koncentracije metanolа, šta poboljšava ukupnu učinkovitost fermentacije.

1.4 Biomasa-stat

Strategija biomass-stat definiše odnos između biomase i dobavljanja metanol, optimizujući brzinu dobavljanja metanol-a kako bi se povećao nagomilavanje proteina. Online praćenje biomase je praktičnije, a metoda fluo citoometrije je poželjna. Na skali od 1000L, optimizacija brzine dobavljanja metanol-a značajno poboljšava aktivnost enzima, nagomilavanje i produktivnost, premašavajući fermentaciju u flaši.

Ko-dobavljajuća strategija

Glicerol, kao inhibitor promotor AOX1, mora biti potpuno iskorišćen prije indukcije metanol-om da ne bi pritiskao proizvodnju proteina. Ko-podložci mogu poboljšati aktivnost enzima, ali prekomerno količine glicerola mogu štetiti rastu i izražavanju. Sorbitol, askorbinska kiselina, manitol i drugi mogu zameniti glicerol, smanjujući proteolizu i vreme kultiviranja, i poboljšavajući izražavanje proteina.

Banka štrama zahteva uvođenje odgovarajućih metoda sačuvanja i postavljanje u odgovarajuće okruženje kako bi se održao stabilnost karakteristika štrama. Yaohai Bio-Pharma može da ispunjava zahteve za čuvanjem glicerolovog štapa (preko ultra-niskotemperaturnih hladnjaka ili tekućeg azota) i za sušenje pod vakuom kvasaca i E. coli.

Strategija uzrokovana ograničenjima

U Pichia pastoris, ograničujuće uslove poput niske DO, koncentracije metanol-a i ograničenja kiseonika poboljšavaju izraz rekombinantnih proteina. Uslovi s ograničenjem kiseonika aktiviraju AOX1 promotor preko akumulacije metanol-a, povećavajući izlaz proteina dok smanjuju toplinu. Indukcija na niskim temperaturama povećava dobijanje, aktivnost, stabilnost i živost ćelija, ali povećava troškove hlađenja. pH i ograničenje azota takođe podržavaju izraz, sa potrebnom pažnjom da se izbegnu operativni problemi. Ograničenje azota značajno povećava specifičnu proizvodnju proteina.

Yaohai Bio-Pharma takođe aktivan je u pretrazi globalnih partnera, institucija ili pojedinki, i nudi najkonkurentsiju naknadu u industriji. Ako imate bilo kakva pitanja, slobodno nas kontaktirajte: [email protected]