Odkrivanje skrivnosti visokokakovostne ekstrakcije plazmidov

Iztrg plazmidne DNA je ključnega pomena za raziskovalce. Kot geni vektorji so plazmidi pomembni v raziskovanju cepov in genetski terapiji, kjer je kakovost odločilna. Ključni dejavniki kakovosti vključujejo delež superzavijene oblike in vsebovanje endotoksinov. Predpisi se različijo: FDA ≥80%, SMPA ≥85%, NMPA ≥90%, z <5% linearno/odprto-krožno DNA. Stranki pogosto pristnjejo ≥95% superzavijene oblike. Ravnotežja endotoksinov so: za raziskave (>50 EU/µg), transfekcija (<50 EU/µg) in brez endotoksinov (<0.1 EU/µg).

Superzavijena plazmidna DNA

Plazmide iz Escherichia coli vsebujejo superzavijeno (SC), odprto-krožno (OC) in linearno (L) DNA. Visok delež SC oblike poveča učinkovitost transfekcije in izraz. Na primer, transfekcija plazmida s 85,45% SC je 2,5x višja, in izraz HGF plazmida s 93,28% SC je 1,8x višji, kar potrjuje prednost SC DNA.

Odprto-krožna DNA: Ko se ena žica dvožične DNA prelomi, postane superzavijena struktura lučnejša, oblikuje pa se odprto-krožni plazmid z večjim prostornim obsegom, ki se med elektroforezo najpočasneje premakne in je postavljen na vrhu.

Linearna DNA: Ko se obe žici plazmidne DNA prelomita, se oblikuje linearna struktura, ki ima relativno manjši prostorni obseg in se premakne hitreje kot odprto-krožna DNA, vendar počasneje kot superzavijena DNA, postavljena je druga.

Superzavijena DNA: Dve helksi sta medsebojno zavite, zavijajo pa se v superzavijeno strukturo, ki temelji na helksi DNA. Imejo najmanjši prostorni obseg in se med elektroforezo najhitreje premakne, postavljena je na dnu.

Količinska analiza deleža superzavijene DNA

Laboratoriji uporabljajo agarovsko gel elektroforezo (AGE) in Gel-Pro Analyzer za oceno deleža superzavijene DNA preko sliki elektroforeze. Ena slika prikazuje 97,539 % SC DNA, druga pa 63,833 % SC in 36,167 % OC DNA (linearna DNA ni vidna).

Skrito endotoksinov v plazmidih

Endotoksin je sestavljalec zunanje plasti stene Gram-negativnih bakterij, ki se sprostavlja po bakterijski smrti ali lizigaciji in vsebuje toksično lipopolisacharido A. Med izluščevanjem plazmidov se endotoksin pridruži rešitvi za lizigacijo, kar vpliva na učinkovitost transfekcije in izvaja nespecifične imunsko odzive, kar lahko pripelje do lažnih pozitivnih rezultatov v poskusih.

Količinska in kakovostna analiza endotoksina

Test Limulus amebocyte lysate (LAL) odkriva endotoksin prek aglutinacije z 2-keto-3-deoksioktonovno kislino (KDO) v lipopolisacharidu (LPS). Test je kakovostni in polkoličinski, saj pokaže prisotnost endotoksina prek zakrpe ali spremembe barve, ko se meša z vzorci.

Yaohai Bio-Pharma ponuja endotoksin-proste superzavite plazmode. Izvajanje storitve pri Yaohai poveča učinkovitost transfekcije in ekspresije. Dostavljene plazmode imajo delež ≥95% SC (povprečno 85%±10%) in raven endotoksina ≤0,1, ≤0,01 ali ≤0,005 EU/μg.

Prav tako aktivno iščemo globalne partnerje, institucije ali posameznike. Ponujamo največje naknadne plačilo v industriji. Če imate katere koli vprašanja, nas prosimo, da nas svobodno kontaktirate: [email protected]