Оптимизация процесса очистки рекомбинантного человеческого инсулина

В последние годы рост числа пациентов с диабетом стимулировал спрос на инсулин, но доступный инсулин находится в недостатке. Эффективное и экономичное производство инсулина имеет решающее значение. В основном он производится с использованием Escherichia coli (E. coli) и дрожжей из-за быстрого роста и низкой стоимости, однако E. coli сталкивается с сложной обработкой на последующих этапах.

Обзор процесса последующей обработки:

Очистка рекомбинантного человеческого инсулина из inclusion bodies E. coli включает несколько этапов, таких как восстановление, промывание, растворение и окисление, расщепление, замена буфера, хроматографическая очистка, выпадение в осадок, ренатурация, ферментативное расщепление и формирование.

Yaohai Bio-Pharma обладает обширным опытом в производстве и очистке рекомбинантного инсулина, а также командой экспертов, что гарантирует высокую эффективность вашего производства инсулина. Опираясь на опыт сотен проектов, Yaohai любезно подводит итоги о том, как оптимизировать процесс последующей очистки рекомбинантного человеческого инсулина.

Восстановление и промывка inclusion body:

Клетки разрушаются с использованием механических методов (например, ультразвуковой диспергации, высокодавленной гомогенизации) или обработкой лиозимом, за которой следуют буферные растворы для промывки (содержащие уреа, Triton X-100 и т.д.) для удаления примесей. Во время промывки необходимо оптимизировать параметры, чтобы обеспечить качество белка при контроле затрат.

Денатурация и окисление inclusion body:

Используются высокоактивные денатуранты (например, гуанидин хлорид и уреа) для растворения inclusion body, с добавлением дитиотреитола или β-меркаптоэтанола для предотвращения образования неправильных дисульфидных связей. pH и температура значительно влияют на реакции растворения и окисления.

Расщепление и замена буфера:

Расщепление цианогенбромидом используется для удаления N-терминальной инициирующей аминокислоты, но оно вызывает проблемы токсичности и низкой специфичности. Через диализ, ультрафильтрацию или хроматографию на размерах молекул обмен буфера удаляет вредные реагенты в подготовке к последующим операциям.

Хроматографическая очистка и осаждение:

Для очистки инсулина используются различные хроматографические методы, включая афинную хроматографию, ионообменную хроматографию, обратнофазовую хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий и хроматографию на размерах молекул. Методы осаждения, такие как осаждение при изменении pH и кристаллизация цинком, используются для удаления примесей и концентрации белков.

Ренатурация:

Растворимый белок разбавляется в буфере ренатурации для содействия правильному образованию дисульфидных связей и складыванию белка. Хроматография жидкости складывания белка и диализ также являются методами, используемыми для ренатурации.

Энзимное расщепление и формирование:

Трипсин и карбоксипептидаза B используются для расщепления пептида C, формируя активный инсулиновый гетеродимер. Наконец, кристаллизация и лиофилизация применяются для удаления остаточных солей и буферов, готовя стабильную формулу. К специфическим добавкам (например, цинк и протамин) добавляют для удовлетворения различных клинических потребностей.

Заключение:

Обработка инсулина на этапе после получения из E. coli является сложной. В будущем следует сосредоточиться на оптимизации этих этапов для эффективного и экономичного производства с целью удовлетворения спроса и снижения затрат.

Yaohai Bio-Pharma также активно ищет глобальных партнеров среди учреждений или частных лиц и предлагает наиболее конкурентоспособное вознаграждение в отрасли. Если у вас есть вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам: [email protected]