Prepararea mRNA prin IVT

Transcripția in vitro (IVT) este metoda preferată pentru pregătirea mRNA, fiind capabilă să producă micrograme până la miligrame de mRNA la scară de laborator. Pentru scopuri de cercetare, furnizorii de reagenti au dezvoltat sisteme de reacție IVT versatile, potrivite pentru mRNA de lungime moderată (1000-4000 deucleotide).

În această articol, vom rezuma transcripția in vitro (IVT) a mRNA, inclusiv sistemul de reacție IVT convențional folosit la scară de laborator și sistemul de reacție IVT potrivit pentru mRNA ultra-lung (>9000 deucleotide).

Seturile permit cufărarea co-transcripțională cu CleanCap AG și reducerea imunogenicității cu m1ψ. DNase I elimină DNA-ul residual. Performanța scăzută poate fi cauzată de amestecare neeficientă, oxidarea reagentelor sau probleme ale șablonului de DNA, care pot fi mitigate prin centrifugare, utilizarea reagentelor proaspete, controale și ajustarea cantității de șablon sau timpului de reacție.

Yaohai Bio-Pharma oferă diverse produse prefabricate de IVT RNA (lichid/pulbere liofilizată) și produse finale LNP, care codifică proteine precum proteine fluorescente (eGFP, mCHERRY), luciferaza, recombinaza Cre și antigenul OVA, pentru a satisface diferitele nevoi experimentale sau de proiect.

Sistem IVT pentru mRNA ultra-lung

IVT convențional nu funcționează pentru mRNA prea lung (>9000 nt). Este necesară o înțelegere adâncă și ajustări raționale ale componentelor IVT.

Șablon DNA: Plasmide linearizate sau produse PCR cu secvențe de promotor corespunzătoare, dizolvate în H2O fără RNase. Se recomandă o concentrație a șablonului DNA mai mare de 40 nM pentru condiții IVT optime.

DTT: Menține activitatea enzymatică în timpul transcrierii. Trebuie adăugat DTT frescură în bufferul de reacție pentru a asigura activitatea enzymatică optimă.

Inhibitor RNase: Inhibă activitatea RNase și menține stabilitatea mRNA.

Polimeraza RNA T7: Catalizează transcrierea ADN-ului în ARN, corespunzătoare secvenței promotor. Activitatea polimerazei T7 RNA este influențată de pH și de ionii magneziu.

Ionii Magneziu (Mg2+): Un cofactor pentru polimeraza RNA. Concentrații prea mici reduc eficiența de transcriere, în timp ce concentrații prea mari conduc la degradarea ARN. [Mg2+] liber trebuie ajustat în funcție de concentrația de nucleotide. Fiecare nucleotid chelatează un [Mg2+], prin urmare concentrația [Mg2+] trebuie să depășească concentrația totală de nucleotide.

Nucleoside Triosphate (NTP): Ca substracte, NTP-uri sunt unitățile de bază ale ARN. Concentrațiile NTP de peste 7 mM au un impact pozitiv asupra producției de mRNA.

Spermidină: Stabilizează complexele DNA-enzim și stimulează reacțiile de transcriere; cu toate acestea, concentrațiile excesive au efecte inhibitoare. Concentrația recomandată de spermidină este între 1 și 3 mM.

Pirofosfatasa Inorganică (PPase): Adăugat în reacțiile IVT pentru a preveni acumularea de ioni de pirofosfat inorganic (PPi), evitând chelarea lor cu Mg2+ și asigurând suficient Mg2+ liber.

Folosind tehnologia pionieră și experiența în IVT mRNA, Yaohai Bio-Pharma oferă un serviciu complet de IVT RNA, cuprinzând proiectarea secvențelor, pregătirea IVT RNA (cu modificări m1ψ), ciclizarea RNA, purificarea, liofilizarea, incapsularea LNP și testarea calitativă.

Cautăm activ parteneri instituționali sau individuali la nivel global. Ofertăm cea mai competitivă compensație din industrie. Dacă aveți întrebări, nu ezitați să ne contactați: [email protected]