Otimizando o Processo de Purificação para Insulina Humana Recombinante

Nos últimos anos, o crescimento do número de pacientes com diabetes tem impulsionado a demanda por insulina, mas insulina acessível está em oferta limitada. A produção eficiente e econômica de insulina é crucial. Produzida principalmente via Escherichia coli (E. coli) e levedura devido ao rápido crescimento e baixo custo, a E. coli enfrenta processamento downstream complexo.

Visão geral do Processamento Downstream:

A purificação da insulina humana recombinante a partir dos corpos de inclusão de E. coli envolve várias etapas, incluindo recuperação, lavagem, solubilização e oxidação, clivagem, troca de tampão, purificação cromatográfica, precipitação, renaturação, clivagem enzimática e formulação.

A Yaohai Bio-Pharma possui ampla experiência na produção e purificação de insulina recombinante, além de uma equipe de especialistas, garantindo que sua produção de insulina seja concluída com alta eficiência. Com base na nossa experiência em centenas de projetos, a Yaohai gentilmente resume como otimizar o Processo de Purificação Downstream para Insulina Humana Recombinante.

Recuperação e Lavagem do Corpo de Inclusão:

As células são desintegradas usando métodos mecânicos (como ultrassom, homogeneização de alta pressão) ou tratamento com lisozima, seguido por tampões de lavagem (contendo ureia, Triton X-100, etc.) para remover impurezas. Durante a lavagem, os parâmetros precisam ser otimizados para garantir a qualidade da proteína enquanto controlam os custos.

Solubilização e Oxidação do Corpo de Inclusão:

Usam-se denaturantes em alta concentração (como hidrocloreto de guanidina e ureia) para solubilizar corpos de inclusão, com adição de ditiotreitol ou β-mercaptoetanol para evitar a formação de ligações dissulfídricas incorretas. O pH e a temperatura impactam significativamente as reações de solubilização e oxidação.

Cleavage e Troca de Buffer:

A clivagem com brometo de cianogênio é usada para remover o aminoácido inicial N-terminal, mas apresenta problemas de toxicidade e baixa especificidade. A troca de tampão, por diálise, ultrafiltração ou cromatografia de exclusão por tamanho, remove reagentes nocivos em preparação para operações subsequentes.

Purificação Cromatográfica e Precipitação:

Várias técnicas cromatográficas são empregadas para purificar a insulina, incluindo cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão por tamanho. Métodos de precipitação, como precipitação por pH e cristalização com zinco, são usados para remover impurezas e concentrar proteínas.

Renaturação:

A proteína solubilizada é diluída em um tampão de renaturação para promover a formação correta dos pares de pontes dissulfídricas e do dobramento da proteína. Cromatografia líquida de dobramento de proteínas e diálise também são métodos utilizados para renaturação.

Clivagem Enzimática e Formulação:

A tripsina e a carboxipeptidase B são usadas para cleavar o peptídeo C, formando o heterodímero de insulina ativo. Por fim, a cristalização e liofilização são empregadas para remover sais e tampões residuais, preparando uma formulação estável. Aditivos específicos (como zinco e protamina) são adicionados para atender a diferentes necessidades clínicas.

Conclusão:

Processamento downstream de insulina de E. coli é complexo. O foco futuro deve ser otimizar essas etapas para produção eficiente e econômica, atendendo à demanda e reduzindo custos.

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