Wykorzystanie mocy strategii fermentacji fed-batch

Pichia pastoris jest powszechnie używana w produkcji różnych białek heterologicznych. Technologia Fermentacji Wysokoczęstotliwościowej (HCDF), realizowana za pomocą karmienia Fed-Batch, pomyślnie osiągnęła wielkoskalową produkcję biopreparatów i enzymów przemysłowych. W precyzyjnie kontrolowanym środowisku odżywczym zastosowanie technologii HCDF pozwala uzyskać wysokowydajne, wysoce aktywne oraz kosztodajne białka rekombinacyjne.

Ostatnie badania wskazują, że dzięki strategiom HCDF prowadzi się prace nad zwiększeniem produkcji i aktywności białek heterologicznych w Pichia pastoris. Technologia HCDF umożliwia łatwe uzyskanie wysokiego gęstościowego skupienia komórek w określonych środkach odżywczych, co pozwala na pozyskanie obfitych ilości białek rekombinacyjnych o zwiększonej aktywności i obniżonych kosztach za pośrednictwem HCDF. Jednak wybór odpowiedniej strategii HCDF do optymalizacji wysokiej ekspresji określonych białek w Pichia pastoris pozostaje wyzwaniem.

Fermentacja Wysokoczęstotliwościowa (HCDF)

Pichia pastoris wyznacza się w produkcji białek heterologicznych, jest polecana dla HCDF w bioreaktorach zautomatyzowanych. HCDF składa się z 3 etapów: wsadowego glukozy, karmienia oraz indukcji metanolem. Yaohai Bio-Pharma może pochwalić się ponad dziesięcioletnim doświadczeniem w fermentacji mikrobiologicznej i wykonało ponad 400 projektów. Firma dysponuje szeroką ekspertyzą i dobrze rozwiniętą technologią, co umożliwia stosowanie różnych strategii HCDF w celu poprawy efektywności produkcji białek.

Metanol pełni rolę zarówno indukatora AOX1, jak i źródła węgla, ale jego stężenie musi być kontrolowane, aby uniknąć toksyczności. Ocena różnych strategii doprowadzania metanolu jest kluczowa dla optymalizacji wzrostu Pichia pastoris i ekspresji białek.

Strategia indukcji metanolem

W strategii indukcyjnej HCDF z podawaniem metanolu w trybie fed-batch, strategie oparte na stanie obejmują zestaw metod kontroli regulujących dodatkowe wprowadzanie metanolu za pomocą kontroli online/offline lub progresywnych/retrogradnych. Wśród strategii statystycznych główne to μ-stat, statystyka tlenku metanowego (DO)-stat, methanol-stat i biomass-stat.

1.1 μ-stat

strategia μ-stat utrzymuje biomasy stałe poprzez kontrolę μ, wspomagając powtarzalność oraz badanie wpływu μ na wyrażenie białek. Jednakże brak bezpośredniego sterowania metanolem i DO może prowadzić do ryzyka akumulacji i generowania ROS.

1.2 DO-stat

Strategia DO-stat pośrednio reguluje dopływ metanolu poprzez kontrolę tlenku rozpuszczony w celu utrzymania tlenacji, ale nie ustala stężenia metanolu i tempa wzrostu, co może wpływać na badanie wyrażania białek. Tlenacja stanowi wyzwanie w fermentacji aerobicznej, a mimo że uzupełnianie czystego tlenu może być kosztowne i toksyczne, zwiększenie ciśnienia jest bardziej ekonomicznym rozwiązaniem, które może również poprawić aktywność białka.

1.3 Methanol-stat

Niedostateczna kontrola stężenia metanolu narzuca ograniczenia zarówno dla strategii μ-stat, jak i DO-stat. Strategie statystyczne metanolowe, które działają w trybie on/off, są podatne na wahania i brak precyzji. W przeciwieństwie do nich, kontrolery PID oferują dokładniejszą regulację stężenia metanolu, co poprawia ogólną efektywność fermentacji.

1.4 Biomass-stat

Strategia biomass-stat definiuje związek między biomasą a dozowaniem metanolu, optymalizując tempo dozowania metanolu w celu zwiększenia wydajności białek. Monitorowanie biomasy online jest bardziej praktyczne, a metodą wyboru jest cytofloregram. W skali 1000L optymalizacja tempa dozowania metanolu istotnie poprawia aktywność enzymów, wydajność i produktywność, przewyższając fermentację w kolbach.

Strategia współdozowania

Gliceryna, jako inhibitor promotorowy AOX1, musi zostać całkowicie zużyta przed indukcją metanolową, aby uniknąć tłumienia produkcji białek. Współsubstraty mogą zwiększać aktywność enzymów, ale nadmiar gliceryny może szkodzić wzrostowi i ekspresji. Sorbitol, kwas askorbinowy, mannitol oraz inne mogą zastąpić glicerynę, zmniejszając proteolizę i czas uprawy oraz zwiększając ekspresję białek.

Bank szczepów wymaga przyjęcia odpowiednich metod konserwacji i umieszczenia w odpowiednim środowisku, aby utrzymać stabilność cech szczepu. Yaohai Bio-Pharma może zaspokoić wymagania dotyczące przechowywania glicerynowego (za pomocą mroźników o niskiej temperaturze lub ciekłym azotem) oraz metody konserwacji przez suszenie próżniowe drożdży i E. coli.

Strategia indukowana przez ograniczenia

W Pichia pastoris warunki ograniczające, takie jak niska zawartość DO, stężenie metanolu i limit tlenu, wzmacniają wyrażanie białek rekombinacyjnych. Warunki ograniczone tlenem aktywują promotor AOX1 poprzez akumulację metanolu, co zwiększa wydajność produkcyjną białek, jednocześnie redukując wydzielanie ciepła. Indukcja przy niskich temperaturach zwiększa wydajność, aktywność, stabilność i przetrwanie komórek, ale wiąże się z dodatkowymi kosztami chłodzenia. Regulacja pH i ograniczenie azotu również wspomagają wyrażanie, wymagając ostrożności, aby uniknąć problemów operacyjnych. Ograniczenie azotu znacząco zwiększa wydajność produkcyjną białek na komórkę.

Yaohai Bio-Pharma aktywnie poszukuje globalnych partnerów instytucjonalnych lub indywidualnych i oferuje najbardziej konkurencyjne wynagrodzenie w branży. Jeśli masz jakiekolwiek pytania, prosimy o kontakt: [email protected]