Ottimizzazione del processo di purificazione per l'insulina umana ricombinante

Negli ultimi anni, l'aumento dei pazienti con diabete ha stimolato la domanda di insulina, ma l'insulina accessibile è in scarsa disponibilità. La produzione efficiente ed economica di insulina è fondamentale. Prodotta principalmente tramite Escherichia coli (E. coli) e lieviti a causa della crescita rapida e del basso costo, l'E. coli si confronta con processi downstream complessi.

Panoramica del Processo Downstream:

La purificazione dell'insulina umana ricombinante dagli inclusion bodies di E. coli prevede numerosi passaggi, inclusi il recupero, il lavaggio, la solubilizzazione e l'ossidazione, il taglio, lo scambio di tampone, la purificazione cromatografica, la precipitazione, la renaturazione, il taglio enzimatico e la formulazione.

Yaohai Bio-Pharma si vanta di avere un'ampia esperienza nella produzione e purificazione dell'insulina ricombinante, unita ad un team di esperti, garantendo che la tua produzione di insulina venga completata con alta efficienza. Sfruttando l'esperienza acquisita da centinaia di progetti, Yaohai riassume gentilmente come ottimizzare il Processo di Purificazione Downstream per l'Insulina Umana Ricombinante.

Recupero e lavaggio del corpo di inclusione:

Le cellule vengono disruptate utilizzando metodi meccanici (come l'ultrasonificazione, l'omogeneizzazione ad alta pressione) o trattamento con lisozima, seguiti da buffer di lavaggio (che contengono urea, Triton X-100, ecc.) per rimuovere le impurità. Durante il lavaggio, i parametri devono essere ottimizzati per garantire la qualità della proteina mentre si controllano i costi.

Solubilizzazione e ossidazione del corpo di inclusione:

Si utilizzano denaturanti ad alta concentrazione (come cloruro di guanidina e urea) per solubilizzare i corpi di inclusione, aggiungendo ditioltreitolo o β-mercaptoetanolo per prevenire la formazione di legami disolfuro errati. pH e temperatura influenzano in modo significativo le reazioni di solubilizzazione e ossidazione.

Cleavage e scambio di buffer:

La scissione con bromuro di cianuro viene utilizzata per rimuovere l'amminoacido iniziale terminale N, ma presenta problemi di tossicità e bassa specificità. Attraverso dialisi, ultrafiltrazione o cromatografia per esclusione dimensionale, lo scambio di tampone rimuove reagenti dannosi in preparazione per le operazioni successive.

Purificazione Cromatografica e Precipitazione:

Vengono impiegate diverse tecniche cromatografiche per purificare l'insulina, inclusa la cromatografia affinitativa, la cromatografia ionica, la cromatografia a fase inversa, la cromatografia per interazione idrofobica e la cromatografia per esclusione dimensionale. I metodi di precipitazione, come la precipitazione a pH e la cristallizzazione al zinco, vengono utilizzati per rimuovere impurità e concentrare le proteine.

Rennaturazione:

La proteina solubilizzata viene diluita in un tampone di rennaturazione per promuovere la formazione corretta dei legami disolfuro e del piegamento della proteina. La cromatografia liquida per il piegamento delle proteine e la dialisi sono anche metodi utilizzati per la rennaturazione.

Scissione Enzimatica e Formulazione:

La tripsina e la carbossipeptidasi B vengono utilizzate per tagliare il C-peptide, formando l'eterodimero di insulina attiva. Infine, la cristallizzazione e la liofilizzazione vengono impiegate per rimuovere sali e buffer residui, preparando una formulazione stabile. Vengono aggiunti additivi specifici (come lo zinco e la protamina) per soddisfare diverse esigenze cliniche.

Conclusione:

Elaborazione downstream dell'insulina da E. coli è complessa. Il focus futuro dovrebbe essere sull'ottimizzazione di questi passaggi per una produzione efficiente ed economica in grado di soddisfare la domanda e ridurre i costi.

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